【导读】染色体外环状DNA （extracchromosomal circular DNA, eccDNAs）是由环状和可移动DNA分子组成的不同基因组实体，但其在乳腺癌（breast cancer， BC）中的分子功能和影响尚不清楚。
10月16日，绍兴市人民医院研究团队在期刊《Cell Reports》上发表了研究论文，题为“Genome-wide characterization of extrachromosomal circular DNA in breast cancer and its potential role in carcinogenesis and cancer progression”，本研究使用Circle-seq分析了19例BC组织和17例癌旁正常组织的eccDNAs。研究人员发现eccDNA存在于所有染色体上，并富集在与BC通路相关的7个eccDNA热点基因（HSGs）中。研究人员发现了几个包含完整基因的eccDNAs （ecgenes）和包含miRNAs的eccDNAs (ecmirs)，它们与癌症相关通路相关。合成的eccMIR6748、ecmir6508和ecmir3142可上调MCF-7细胞中miRNA的表达，其中ecmir6748通过上调miR-6748在转录后水平抑制肿瘤抑制候选因子5 （TUSC5）促进BC细胞的迁移和侵袭。此外，eckmir6748还通过p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路影响BC的进展。这些发现表明，包含功能性基因组片段的eccDNAs在BC的起始和进展中发挥作用，提供了基因组可塑性的动态来源和作为生物标志物和治疗靶点的潜力。
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(24)01196-3
背景信息
01
乳腺癌是全球女性肿瘤相关死亡的主要原因，每年约有230万新病例报告。它是一种复杂和高度异质性的疾病，受遗传学的强烈影响，并由不同的亚型组成。目前，有多种生物标志物用于BC的分子分型，包括病理学标志物[雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2 （HER2）、Ki-67]、癌基因体细胞突变（BRCA1、BRCA2、PIK3CA等）和免疫标志物（肿瘤浸润淋巴细胞、PD-L1等），BC的分子分型为精准医学提供了靶向治疗、免疫治疗和耐药预测的可能。然而，尽管取得了这些进展，BC患者的临床结局仍然欠佳，这强调了我们需要更好地了解这种疾病的分子特征。
染色体外环状DNA （ecDNA）于1964年首次在野猪精子和小麦胚胎中发现，之后被发现广泛存在于从酵母到人类的真核生物中。它是一种可以从线性染色体移动的环状DNA分子。eccDNAs可起源于基因组中的任何地方，并可根据其来源、大小、序列和其他特征进行分类。这些分类包括线粒体环状DNA （mtDNA）、双微体染色体（DMs）、染色体外DNA （ecDNA）、微小DNA （microDNA）等。
虽然eccDNA片段的长度差异很大，从约100个碱基对（bp）到兆碱基大小，但大多数eccDNA的大小很小（<500 bp），以前称为微小DNA。这些组件随机产生于核基因组的所有区域，可以包含从小的非编码区到整个基因的任何基因组组件，使其与染色体DNA同源。然而，由于缺乏可识别的着丝粒，eccDNA在细胞有丝分裂过程中不均匀地分离到两个子细胞中。这种不均匀的分离与细胞异质性、肿瘤进展或转移以及耐药密切相关。
eckmir6748通过上调miR-6748促进BC细胞的迁移和侵袭
02
由于miR6748在ddPCR中表现出最高的增强miRNA表达，研究人员进一步研究了eccMIR6748与BC的相关性。首先，迁移实验进一步表明，转染ecmcmir6748后，MCF-7细胞的迁移和侵袭能力增加。为了评估过表达miR-6748对MCF-7细胞增殖的影响，研究人员进行了EDU实验，但未观察到明显的变化。
eckmir6748通过上调miR-6748促进BC细胞的迁移和侵袭
为探究eccmri6748在乳腺癌中致癌活性的分子机制，研究人员应用TargetScan和MicroT-CDS预测miR-6748与其靶基因的相互作用概率。研究人员预测出501个靶基因为miR-6748的靶基因，并利用TissGDB数据库进一步筛选BC的特异性表达基因，发现只有一个基因tusc5 （tumor suppressor candidate factor 5）与BC相关。GEPIA工具进一步分析显示TUSC5在BCTs中的表达显著低于对照组。同时，通过TargetScan数据库预测TUSC5与miR-6748的相互作用，双荧光素酶报告基因分析显示，与MCF-7/阴性对照（NC） WT组相比，MCF-7/miR-6748野生型（WT）组的相对发光活性显著降低。
为了证实TUSC5与miR-6748的相互作用，研究人员合成了TUSC5-3- utr - wt和TUSC5-3- utr -MUT（突变体），相互作用区域的破坏极大地阻碍了TUSC5-3- utr -MUT与miR-6748的相互作用，结果显示MCF-7/NC MUT组与MCF-7/miR-6748 MUT组之间没有明显差异。研究人员进一步研究了这种相互作用，发现在miR-6748过表达时，TUSC5蛋白的表达被显著抑制，在miR-6748过表达时，TUSC5蛋白的表达被显著上调。虽然miR-6748水平的变化不影响TUSC5 mRNA的表达，但研究结果推测TUSC5在转录后水平受到miRNAs的调控。因此，这些结果表明，eccMIR6748通过上调miR-6748调控BC细胞的迁移和侵袭能力。
ecmir6748在BC细胞中促进肌动蛋白聚合
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为了验证eccMIR6748表达的增加是否通过增强F-actin聚合来促进MCF-7细胞的趋化作用，研究人员进行了F-actin聚合实验。结果表明，表皮生长因子（EGF）可诱导ecmir6748 /MCF-7细胞在2 min和15 s时F-actin聚合增加。在eccMIR6748/MCF-7细胞中，肌动蛋白聚合显著增加，表明eccMIR6748在细胞骨架重排中的重要作用。免疫荧光染色检测了f -肌动蛋白水平。EGF诱导了ecmir6748 /MCF-7细胞中F-actin含量的增加，而Scr/MCF-7细胞中没有。随后，研究人员研究了ecmir6748是否通过p38 MAPK信号通路影响癌细胞。研究显示，过表达eccMIR6748显著增加p-p38的表达。此外，在EGF刺激2 min后，p-p38的表达显著增加。而JAK2的表达不受eccMIR6748的影响。接下来，研究人员使用p38 MAPK抑制剂SB203580来验证结果。用SB203580处理MCF-7细胞后，eccMIR6748组p-p38蛋白水平显著降低。然后，研究人员研究了eccMIR6748是否通过p38 MAPK信号通路影响LIMK/cofilin。LIMK和cofilin是参与F-actin动态调控的两个关键因子。研究显示，eccMIR6748的表达增加促进了LIMK和丝切蛋白的磷酸化，p-p38的表达增加也是如此。综上所述，这些研究结果表明，MCF-7细胞中eccMIR6748的表达增加通过调节LIMK/cofilin的磷酸化来促进显著的细胞骨架重塑。